Определение общего билирубина в сыворотке крови

Определение общего билирубина в сыворотке крови

 

Ключевые слова: лакказа Bacillus pumilis билирубин оксидазная активность общий билирубин сыворотка крови

Игорь Леонидович Глухов — к.б.н., инженер, лаборатория молекулярной микробиологии, ИБФМ РАН (Москва)
E-mail: glukhovi1@rambler.ru
Александр Сергеевич Солонин — д.б.н., зав. лаборатория молекулярной микробиологии, ИБФМ РАН (Москва)
E-mail: solonin.a.s@ya.ru
Алексей Аркадьевич Леонтьевский — д.б.н., врио директора, ИБФМ РАН (Москва)
E-mail: leont@ibpm.pushchino.ru

В клинико-диагностических лабораториях в настоящее время для определения концентрации билирубина наиболее часто применяют диазометод. Диазометод – колориметрический метод – основан на реакции билирубина с диазоти-рованной сульфаниловой кислотой (или другими диазосоединениями) с образованием окрашенного продукта – диазо-билирубина. Недостатками диазометода является нестабильность самих диазореагентов и высокая токсичность ис-ходных реагентов. Предлагаемый ферментативный способ определения общего билирубина основан на реакции окисления билирубина бактериальной лакказой. Было обнаружено, что бактериальная лакказа (белок CotA) обладает билирубин оксидазной активностью. Высокое сродство фермента к билирубину по сравнению с другими компонентами крови делает возможным использование его для измерения концентрации билирубина в сыворотке крови. В предлагаемом способе исследуемую сыворотку крови инкубируют в натрий-фосфатном буфере, содержащем детергент и фермент; наблюдаемое в ходе реакции уменьшение оптической плотности реакционной смеси при 450 нм вследствие окисления билирубина прямо пропорционально концентрации общего билирубина в сыворотке. Бактериальную лакказу выделяют из штамма-продуцента Escherichia coli M15/pQE30cotA, сконструированного с помощью стандартных генно-инженерных методов. Ген, кодирующий лакказу, клонируют из генома Bacillus pumilus B-508 с помощью ПЦР-метода в векторную плазмиду pQE30. Полученную рекомбинантную плазмиду pQE30cotA трансформируют в клетки штамма E.coli M15. Способ выделения фермента включает: выращивание клеток штамма-продуцента, инкубирование клеток в присутствии IPTG (индуктора экспрессии лакказы), получение биомассы центрифугированием и последующее ее разрушение ультразвуком, термообработку грубого экстракта при 70°С, хроматографию на анионообменных смолах, концентрирование конечного препарата. Полученный препарат фермента имеет высокую термостабильность и сохраняет исходный уровень активности в течение не менее 6 месяцев при температуре 2…8°C. Все использованные реагенты были стабильны и нетоксичны. Для проверки точности проводимых измерений в качестве анализируемого материала используют контрольную сыворотку с аттестованным средним значением концентрации общего билирубина, равным 73,9±4,8 мкмоль/л, измеренным по методу Йендрашика–Грофа. Концентрация общего билирубина, определенная с помощью описываемого ферментативного способа, в среднем составляет 71,2±1,7 мкмоль/л. Отклонение от аттестованного значения билирубина не превышает 4%. Сравнение ожидаемых концентраций билирубина после соответствующего разведения растворов калибратора или сыворотки с известными значениями билирубина (диапазон разведения составлял 7…244 и 18,5…274 мкмоль/л, соответственно) и результатов измерений указывает на линейность этого определения. Высокое значение коэффициента корреляции (r>0,99) в данном диапазоне разведения означает, что линейная область определения билирубина имеет место, по крайней мере, до 274 мкмоль/л, нижний предел определения – 7,0 мкмоль/л.

Список литературы:

  1. Yamanouchi I., Yamauchi Y., Igarashi I. Transcutaneous bilirubinometry: Preliminary studies of noninvasive bilirubin meter in the Okayama National Hospital // Pediatrics. 1980. V. 65. P. 195–202.
  2. Watson D. Analytic methods for bilirubin in blood plasma // Clin. Chem. 1961. V. 7. P. 603–625.
  3. Tanaka N., Murao S. Purification and some properties of bilirubin oxidase of Myrothecium verrucaria MT-1 // Agric. Boil. Chem. 1982. V. 46. P. 2499–2503.
  4. Otsuji S., Mizuno K., Ito S., Kawahara S., Kai M. A new enzymatic approach for estimating total and direct bilirubin // Clin. Biochem. 1988. V. 21. P. 33–38.
  5. Kurosaka K., Senba S., Tsubota H., Kondo H. A new enzymatic assay for selectively measuring conjugated bilirubin concentration in serum with use of bilirubin oxidase // Clin. Chim. Acta. 1998. V. 269. № 2. P. 25–36.
  6. Patent № 4 937 186 (USА) Method for the determination of bilirubin in solution / Siddiqi Iqval, Mangal Ciaran.
  7. Leontievsky A.A., Myasoedova N.M., Baskunov B.P. et al. Transformation of 2,4,6-trichlorophenol by free and immobilized fungal laccase // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57. P. 85–91.
  8. Chauhan P., Goradia B., Saxena A. Bacterial laccase: recent update on production, properties and industrial applications // 3 Biotech. 2017. V. 7. № 5. P. 32–53.
  9. Jie Yang, Wenjuan Li, Tzi Bun Ng et al. Laccases: production, expression regulation, and applications in pharmaceutical biodegradation // Front. Microbiol. 2017. V. 8. P. 832–856.
  10. Shimizu A., Kwon J.H., Sasaki T., et al. Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase and its mutants for potential copper ligands // Biochemistry. 1999. V.38. № 10. P. 3034-3042.
  11. Патент № 2418072 (РФ). Фотометрический способ определения концентрации общего билирубина в сыворотке крови с помощью бактериальной оксидазы из Bacillus pumilus / И.Л. Глухов, В.В. Шматченко, А.А. Леонтьевский.



Источник: www.Radiotec.ru


Добавить комментарий