Субстрат фермента печени

Субстрат фермента печени

Ферментативная кинетика изучает влияние различных факторов (концентрация S и E, рН, температура, давление, ингибиторы и активаторы) на скорость ферментативных реакций. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является получение информации, позволяющей глубже понять механизм действия ферментов.

Кинетическая кривая позволяет определить начальную скорость реакции V0.

Кривая субстратного насыщения.

График зависимости V от концентрации субстрата при фиксированной концентрации фермента представляет собой гиперболу. Вначале скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата [S] (кинетика первого порядка). Однако при увеличении [S] скорость постепенно достигает максимального значения VMAX. Это означает, что все связывающие участки фермента заняты (насыщены). Скорость реакции на этом участке не зависит от концентрации субстрата (кинетика нулевого порядка). Такую кривую называют кривой субстратного насыщения.

Зависимость скорости реакции от концентрации фермента.

При постоянной концентрации субстрата существует прямо пропорциональная зависимость между скоростью реакции и концентрацией фермента [E] в реакционной смеси. Другими словами, для данной концентрации субстрата скорость реакции возрастает в 2 раза при двукратном увеличении концентрации фермента.

Зависимость скорости реакции от температуры.

Ферменты – вещества белковой природы, проявляют максимальную активность в ограниченном температурном режиме. При температурах не выше 40-50С скорость реакции увеличивается согласно теории химической кинетики. При более высоких температурах тепловая денатурация фермента приводит к полному прекращению ферментативной реакции. Термолабильность ферментов отличает ферменты от неорганических катализаторов.

Зависимость скорости реакции от рН.

Оптимум рН действия большинства ферментов лежит в пределах физиологических значений 6,0-8,0. Пепсин активен при рН 1,5-2,0, что соответствует кислотности желудочного сока. Аргиназа, специфичный фермент печени, активен при 10,0. Влияние рН среды на скорость ферментативной реакции связывают с состоянием и степенью ионизации ионогенных групп в молекуле фермента и субстрата. Этот фактор определяет конформацию белка, состояние активного центра и субстрата, формирование фермент-субстратного комплекса, собственно процесс катализа.

Математическое описание кривой субстратного насыщения, константа Михаэлиса.

Уравнение, описывающее кривую субстратного насыщения, было предложено Михаэлисом и Ментон и носит их имена (уравнение Михаэлиса-Ментен):

V = (VMAX*[S])/(Km+[S]), где Km – константа Михаэлиса. Легко рассчитать, что при V = VMAX/2 Km = [S], т.е. Km – это концентрация субстрата, при которой скорость реакции составляет ½ VMAX.

С целью упрощения определения величины VMAX и Km уравнение Михаэлиса-Ментен можно пересчитать.

1/V = (Km+[S])/(VMAX*[S]),

1/V = Km/(VMAX*[S]) + 1/VMAX,

1/V = Km/VMAX*1/[S] + 1/VMAX уравнение Лайнуивера-Берка. Уравнение, описывающее график Лайнуивера-Берка – это уравнение прямой линии (y = mx + c), где 1/VMAX – это отрезок, отсекаемый прямой на оси ординат; Km/VMAX — тангенс угла наклона прямой; пересечение прямой с осью абсцисс дает величину 1/Km. График Лайнуивера-Бэрка позволяет определить Km по относительно небольшому числу точек. Этот график также используют при оценке действия ингибиторов, о чем будет сказано ниже.

Значение Km изменяются в широких пределах: от 10-6 моль/л для очень активных ферментов, до 10-2 – для малоактивных ферментов.

Оценки Km имеют практическую ценность. При концентрациях субстрата в 100 раз превышающих Km, фермент будет работать практически с максимальной скоростью, поэтому максимальная скорость VMAX будет отражать количество присутствующего активного фермента. Это обстоятельство используют для оценки содержания фермента в препарате. Кроме того, Km является характеристикой фермента, что используется для диагностики энзимопатий.

Ингибирование активности ферментов.

Чрезвычайно характеристикой и важной особенностью ферментов является их инактивация под влиянием определенных ингибиторов.

Ингибиторы – это вещества, вызывающие частичное или полное торможение реакций, катализируемых ферментами.

Ингибирование ферментативной активности может быть необратимым или обратимым, конкурентным или неконкрентным.

Необратимое ингибирование – это стойкая инактивация фермента, возникающая в результате ковалентного связывания молекулы ингибитора в активном центре или в другом особом центре, изменяющим конформацию фермента. Диссоциация столь устойчивых комплексов с регенерацией свободного фермента практически исключена. Для преодоления последствий такого ингибирования организм должен синтезировать новые молекулы фермента.

Обратимое ингибирование – характеризуется равновесным комплексообразованием ингибитора с ферментом за счет нековалентных связей, вследствие чего такие комплексы способны к диссоциации с восстановлением активности фермента.

Классификация ингибиторов на конкурентные и неконкурентные основана на том, ослабляется (конкурентное ингибирование) или не ослабляется (неконкурентное ингибирование) их ингибирующие действие при повышении концентрации субстрата.

Конкурентные ингибиторы – это, как правило, соединения, структура которых сходна со структурой субстрата. Это позволяет им связываться в том же активном центре, что и субстраты, препятствуя взаимодействию фермента с субстратом уже на стадии связывания. После связывания ингибитор может быть превращен в некий продукт или остается в активном центре, пока не произойдет диссоциация.

Обратимое конкурентное ингибирование можно представить в виде схемы:

+I

E↔ E-I → E + P1

+S (неакт)

E-S → E + P

(акт)

Степень ингибирования фермента определяется соотношением концентраций субстрата и фермента.

Классическим примером подобного типа ингибирования является торможение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) малатом, который вытесняет сукцинат из субстратного участка и препятствует его превращению в фумарат:

Ковалентное связывание ингибитора в активном центре приводит к инактивации фермента (необратимое ингибирование). Примером необратимого конкурентного ингибирования может служить инактивация триозофосфатизомеразы 3-хлорацетолфосфатом. Этот ингибитор является структурным аналогом субстрата – диоксиацетонфосфата и необратимо присоединяется к остатку глутаминовой кислоты в активном центре:

Некоторые ингибиторы действуют менее избирательно, взаимодействуя с определенной функциональной группой в составе активного центра разных ферментов. Так, связывание йодацетата или его амида с SH-группой аминокислоты цистеина, находящийся в активном центре фермента и принемающей участие в катализе, приводит к полной утрате активности фермента:

R-SH + JCH2COOH → HJ + R-S-CH2COOH

Поэтому эти ингибиторы инактивируют все ферменты, которые имеют SH-группы, участвующие в катализе.

Необратимое ингибирование гидролаз при действии нервно-паралитических газов (зарин, зоман) обусловлено их ковалентным связыванием с остатком серина в активном центре.

Метод конкурентного ингибирования нашел широкое применение в медицинской практике. Сульфаниламидные препараты – антагонисты п-аминобензойной кислоты, могут служить примером метаболизируемых конкурентных ингибиторов. Они связываются с дигидроптератсинтетазой – бактериальным ферментом, осуществляющим превращение п-аминобензоата в фолиевую кислоту, необходимую для роста бактерий. Бактерия погибает в результате того, что связавшийся сульфаниламид превращается в другое соединение и фолиевая кислота не образуется.

Неконкурентные ингибиторы обычно связываются с молекулой фермента в участке, отличном от места связывания субстрата, и субстрат непосредственно не конкурирует с ингибитором. Поскольку ингибитор и субстрат связываются с разными центрами возможно образование как комплекса E-I, так и комплекса S-E-I. Комплекс S-E-I тоже распадается с образованием продукта, однако с меньшей скоростью, чем E-S, поэтому реакция будет замедляться, но не остановится. Таким образом, могут протекать следующие параллельные реакции:

+I +S

E↔ E-I ↔ S-E-I → E-I + P

+S E-S +I

E + P

Обратимое неконкурентное ингибирование встречается сравнительно редко.

Неконкурентные ингибиторы называют аллостерическими в отличие от конкурентных (изостерических).

Обратимое ингибирование может быть количественно изучено на основе уравнения Михаэлиса-Ментен.

При конкурентном ингибировании VMAX остается постоянной, а Km возрастает.

При неконкурентном ингибировании снижается VMAX при неизменном Km.

Если продукт реакции ингибирует фермент, катализирующий его образование, такой способ ингибирования называется ретроингибированием или ингибированием по принципу обратной связи. Например, глюкоза тормозит глюкозо-6-фосфатазу, которая катализирует гидролиз глюкозо-6-фосфата.

Биологическое значение такого ингибирования – регуляция определенных метаболических путей (см. следующее занятие).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Задание студентам

1. Изучить денатурацию белков под действием растворов минеральных и органических кислот и при нагревании.

2. Обнаружить кофермент НАД в дрожжах.

3. Определить амилазную активность в моче (сыворотке крови).

9. ЭТАЛОНЫ ОТВЕТОВ НА ЗАДАЧИ, тестовые вопросы, используемые при контроле знаний на занятии (можно в виде приложения)

10. ХАРАКТЕР И ОБЪЕМ ВОЗМОЖНОЙ УЧЕБНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ

(Указать конкретно характер и форму УИРС: подготовка реферативных выступлений, проведение самостоятельных исследований, имитационная игра, оформление истории болезни с использованием монографической литературы и др. формы)

11. ЛИТЕРАТУРА ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАНЯТИЮ ПРЕПОДАВАТЕЛЯМ:



Источник: studfile.net


Добавить комментарий